闪烁之光高抽活动主题奖励是啥子

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荧光素酶检测值达到几许算有活性

荧光素酶（英文名称：Luciferase）是天然界中能够产生生物荧光的酶的统称,其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶.在相应化学反应中,荧光的产生是来自于萤光素的氧化,有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）.没有荧光素酶的情况下,萤光素和氧气反应的速率特别慢,而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（和肌肉收缩的情况相似）.[1]荧光生成反应通常分为下面内容两步：

萤光素+ ATP→萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate）+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→氧荧光素+ AMP+光

这一反应特别节省能量,几乎全部输入反应的能量都被转化为光.和之形成鲜明对比的是人类运用的白炽灯,只有越10%的能量被转化为光,剩余的能量都变为热能而被浪费.

荧光素或荧光素酶不是特定的分子,而是对于全部能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称,虽然它们各不相同.不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应.最为人所知的发光生物是萤火虫,而其所采用不同的荧光素酶和其他发光生物如荧光菇（发光类脐菇,Omphalotus olearius）或许多海洋生物都不相同.在萤火虫中,发光反应所需的氧气是从被称为腹部气管（abdominal trachea）的管道中输入.一些生物,如叩头虫,含有多种不同的荧光素酶,能够催化同一荧光素底物,而发出不同颜色的荧光.萤火虫有2000多种,而叩甲总科（包括萤火虫、叩头虫和相关昆虫）则有更多,因此它们的荧光素酶对于分子体系学研究很有用.目前研究得最透彻的荧光素酶是来自Photinini族萤火虫中的北美萤火虫（Photinus pyralis）.

虫荧光素酶 luciferase

亦称发光酶.是催化生物发光的酶系的总称.它是光物质的冷水抽提物在氧中发光时,底物虫荧光素被消耗以后残余的对热不稳定的高分子成分.现在对萤虫相海萤以及发光细菌的虫荧光素酶结晶物的研究得最多.它们属于加氧酶（oxygenase）,不含金属和辅酶.对于发光,有的酶必须以ATP等作为辅助因子,有的则不需要.其发光机制等已了解到可因种的不同而有很大的差异,虫萤光素酶具有高度的特异性,一般仅影响于来自近缘种的虫荧光素.当然,萤虫、海萤的酶是不能互相代替引起发光的.海萤的虫荧光素酶在干燥情形下等于稳定,可以保存

双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术

在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化影响.但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,由于各自的测试化学,处理标准,检测特征存在差异.Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试.双荧光素酶报告基因测试体系,结合pRL载体体系,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便.体系还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品.对于正在运用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员.双荧光素酶报告基因测试体系将使他们立即体会到该体系的便利.

说明

双报告基因用于实验体系中作相关的或成比例的检测,通常壹个报告基因作为内对照,使另壹个报告基因的检测均一化.检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞,带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体.通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础.报告基因表达活力的相对改变和偶联调控启动子转录活力的改变相关,偶联到组成型启动子的第二个报告基因,提供转录活力的内对照,使测试不被实验条件变化所干扰.

通过这种方式,可减少内在的变化影响所削弱的实验准确性,比如,培养细胞的数目和活力的差异,细胞转染和裂解的效率.

运用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍运用.但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势,比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行,但CAT,β-Gal和GUS测试法,则在定量前需要长时刻的保温.另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围,必须注意不要超过这些范围,内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的运用.许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达,不利于准确定量报告基因表达,胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试.虽然在高温下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰,但这些处理也会快速失活荧光素酶.因此,在此类双报告基因检测中,必须以不同的流程分别处理共转染的细胞裂解液.

理想的双报告基因方式应该运用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定.这在传统的报告基因,如CAT,β-Gal和GUS是不也许的,由于它们测试化学,处理标准所固有的局限.相反,结合萤火虫( Photinus pyralis)和海洋腔肠( Renilla reniformis)双荧光素酶, Promega的双荧光素酶报告基因测试(DLR)体系可满足这些标准,在单管中完成这些测试.

双荧光素酶报告基因测试化学

荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特征,但它们在进化上的起源不同,因此,具有不同的酶学结构和底物标准.这些差异用来进步了 DLR测试化学,选择性地不同差异这两种发光报告基因的活力.萤火虫荧光素酶一个 61kDa单亚基蛋白质,酶活力不需翻译后修饰(3,4),在翻译后即可作为遗传报告基因.在 ATP,Mg 2+和 O 2存在下,通过甲虫荧光素的氧化反应发光(图 1).在常规反应条件下,荧光素的氧化发生时,以荧光素-AMP作为中间体,转换特别缓慢.结局,在底物和酶混合后,测试化学产生"闪烁"的光,并迅速衰减.专利化的测尝试剂,定量萤火虫荧光素酶活力,掺入了辅酶 A(CoA),增强快速酶转换来进步反应动力学(5),导致持续的"闪烁"发光信号(图 2).

图 1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

在 DLR测试体系中,用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力.在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后,萤火虫发光被快速湮灭,并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照"报告基因).因此,DLR测试体系整合了两个测试化学,对共表达的两个报告基因作快速地定量,酶来自转染细胞裂解液,或无细胞转录/翻译反应.

萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级,可测定≤1fg(大约10-20摩尔)的实验报告基因酶(图3A).用双荧光素酶报告基因测试体系,海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级,较低的底限是≤ 10fg(大约3×10-19摩尔)的对照报告基因酶(图3B),而且这两个酶的特异活力相似.

图 2用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光.CHO细胞(1×10 6/60mm培养板)共转染pGL3

Control和pRL SV40载体DNA.细胞用PBS洗涤后,加入400μl PLB制成裂解液.将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测尝试剂II(LARII)混合,萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪).100μl Stop&Glo TM试剂加入到荧光照度仪管中,湮灭萤火虫荧光素酶反应,同时激活Renilla荧光素酶反应,并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪).Turner Designs型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射,12秒内完成两次测试.

双荧光素酶报告基因测试体系的方法

定量两个报告基因荧光素酶的发光信号,可在制备裂解液后立刻进行,不需将样品分成小组分或作额外的处理.因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学,作双荧光素酶报告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪.

通常DLR测试,大约需要30秒钟完成,如图4所说明.起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时,将一份裂解产物和荧光素酶测尝试剂II(LAR II)混合.在完成萤火虫荧光素酶测试时,此时萤火虫发光被湮灭,同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光,加入Stop& Glo TM试剂到样品管.在1秒钟内,Stop& Glo TM试剂湮灭大于10 5滴度萤火虫反应的发光信号(图5),并同时激活海洋腔肠荧光素酶.

图 3萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围.纯化的萤火虫和Renilla荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀释,配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光,在开始2秒的预读延迟后.直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时,在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片.在含10fg和100fg的Renilla荧光素酶反应中测试发光,需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号.两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图.

图 4用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方法.如荧光照度仪配有两个加样器,将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中,随后按序自动加入Luciferase Assay Reagent II(LAR II), Stop& GloTM试剂.

PLB裂解液

PLB裂解液(Passive Lysis Buffer),经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞,而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环.虽然PLB设计应用于被动裂解经过中,但它可靠的裂解效果同样有益于运用常规处理方式制作的裂解液.无论运用何种裂解方式,对培养的哺乳细胞而言,释放到PLB裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的(图6).被动裂解液的壹个明显优点,是可以抑制低水平的非酶促发光(自发光),这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有特征.通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光,包括Triton? X-100, Promega的细胞培养裂解试?(CCLR)和报告基因裂解试剂(RLB),这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的发光反应.PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力,使自发光减弱到最低,可提供最优的测试灵敏度,定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶.另外,PLB抑制发泡,特别适合高通量应用,可用于自动化体系中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试.

图 5双荧光素酶报告基因测试体系湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Renilla荧光素酶发光.CHO细胞裂解液有共转染pGL3-Control和pRL SV40载体DNA,按图2描述的方式制备.萤火虫荧光素酶(报告基因1)和Renilla荧光素酶(报告基因2)活力检测在10秒内完成,开始有2秒的预读延迟.为了显示Stop& Glo TM试剂湮灭报告基因1的高效率,加入等体积的Stop& Glo TM试剂(缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应),萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Renilla荧光素酶发光.在这一实验中,湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光,小于未湮灭反应值的0.0004%

霍格沃茨之遗分院测试答案全策略

1.分院测试：黎明还是黄昏？

格兰芬多、拉文克劳：黎明

赫奇帕奇、斯莱特林：黄昏

2.分院测试：森林还是河流？

格兰芬多、拉文克劳：森林

赫奇帕奇、斯莱特林：河流

3.分院测试：月亮还是星星？

格兰芬多、赫奇帕奇：星星

拉文克劳、斯莱特林：月亮

4.分院测试：最厌恶的称呼？

格兰芬多：胆小/懦弱

拉文克劳：无知/愚蠢

赫奇帕奇：自私/忽略

斯莱特林：普通/平凡

5.分院测试：死后的梦想？

格兰芬多：询问更多关于你的冒险的故事

拉文克劳：以钦佩的方法思索你的成就

赫奇帕奇：想你，但微笑

斯莱特林：我不在乎大众在我死后如何看我，重要的是他们在我活着的时候如何看我

6.分院测试：希望怎样被历史所知晓？

格兰芬多：大胆

拉文克劳：智者

赫奇帕奇：好的

斯莱特林：最棒的

7.分院测试：愿意发明的药水？

格兰芬多：荣耀

拉文克劳：聪明

赫奇帕奇：爱

斯莱特林：力量

8.分院测试：Flutterby灌木丛的花朵闻到啥子？

格兰芬多：噼啪作响的原木火

拉文克劳：新鲜羊皮纸

赫奇帕奇：圆则丛家

斯莱特林：海

9.分院测试：选择哪种饮料？

格兰芬多：金色的液体亮得刺眼，让黑子盯含在房间里四处乱舞

拉文克劳：起泡、起泡、银光闪闪的液体，仿佛含有磨碎的钻石

赫奇帕奇：柔滑、浓稠、浓郁的紫色饮料，散发出巧克力和李子的美味气味

斯莱特林：像墨水一样闪闪发光的神奇黑色液体，散发出的烟雾让你看到奇怪的景象

10.分院测试：哪种乐器最令你耳目一新？

格兰芬多：鼓

拉文克劳：钢琴

赫奇帕奇：小号

斯莱特林：小提琴

11.分院测试：进入花园首先检查啥子？

格兰芬多：壹个老巫师的雕像，眼睛奇怪地闪烁着

拉文克劳：银叶树结金苹果

赫奇帕奇：似乎在互相交谈的肥红毒菌

斯莱特林：冒泡的水池，在其深处有啥子发光的物品在旋转

12.分院测试：尝试打开何者盒子？

格兰芬多：锡制的小盒子，朴实无华，上面有一条划痕的信息，上面写着“我只为有价格的人打开”

拉文克劳：瑰丽的金色棺材，站立在爪脚上，上面的铭文警告说，秘密姿势和无法忍受的诱惑都在里面

赫奇帕奇：小小的玳瑁盒子，上面点缀着金色，里面似乎有啥子小生物在吱吱叫

斯莱特林：闪闪发光的漆黑盒子，上面有一把银色的锁和钥匙，上面刻着壹个神奇的符文，你了解它是梅林的印记

13.分院测试：巨魔守卫的橘樱桥怎样应对？

格兰芬多：自愿战斗

拉文克劳：试图迷惑巨魔让你们三个不打架就通过

赫奇帕奇：提议抽签决定你们中的哪壹个将战斗

斯莱特林：提议你们三个都应该战斗(不告知巨魔)

14.分院测试：最难处理的是啥子？

格兰芬多：寂寞

拉文克劳：饥饿

赫奇帕奇：寒冷的

斯莱特林：无聊

15.分院测试：更愿意成为哪种？

格兰芬多：表扬

拉文克劳：模仿

赫奇帕奇：喜爱

斯莱特林：害怕

16.分院测试：如果可以拥有任何力量，你会选择哪一种？

格兰芬多：隐形的力量

拉文克劳：随意改变容貌的力量

赫奇帕奇：超人力量的力量

斯莱特林：改变过去的力量

17.分院测试：最期待在霍格沃茨学到啥子？

格兰芬多：关于城堡的秘密

拉文克劳：我能做到的每壹个魔法领域

赫奇帕奇：全部关于魔法生物，以及怎样和他们交兄弟/照顾他们

斯莱特林：妖术和恶作剧

18.分院测试：最想进修下面内容哪一项？

格兰芬多：狼人

拉文克劳：地精

赫奇帕奇：巨魔

斯莱特林：吸血鬼

19.分院测试：和两个兄弟穿过橘樱桥应对策略？

格兰芬多：自愿战斗

拉文克劳：试图迷惑巨魔让你们三个不打架就通过

赫奇帕奇：提议抽签决定你们中的哪壹个将战斗

斯莱特林：提议你们三个都应该战斗(不告知巨魔)

20.分院测试：室友运用禁止的羽毛笔作弊如何办？

格兰芬多：告知弗立维教授他应该问问你的同学(并决心告知你的同学，如果他不说实话，你会的)

拉文克劳：告知弗立维教授真相。如果你的同学准备通过作弊来取胜，他应该被找出来。由于你们在同壹个房子里，他失去的任何分数都将由你从头获取，由于你会在他的位置上获取第一名。

赫奇帕奇：撒谎说你不了解(但希望别人告知弗立维教授真相)。

斯莱特林：你会迫不及待地被标准告知弗立维教授真相。如果你了解有人在运用禁用的羽毛笔，你会在考试开始前告知老师。

21.分院测试：麻瓜说你确定是女巫或巫师，你如何做？

格兰芬多：同意，接着走开，让他们怀疑你是否在虚张声势？

拉文克劳：问是啥子让他们这么认为？

赫奇帕奇：告知他们你担心他们的心理健壮，并主动打电话给医生。

斯莱特林：同意，并询问他们是否想要不收费的厄运样品？

22.分院测试：何者噩梦会让你最害怕？

格兰芬多：一只眼睛盯着你被锁在里面的黑暗、没有窗户的房间的钥匙孔。

拉文克劳：站在特别高的物品上，突然觉悟到没有手或立足点，也没有任何障碍可以阻止你跌倒。

赫奇帕奇：醒来发现你的兄弟和家人都不了解你是谁。

斯莱特林：被迫用傻乎乎的声音说话，几乎没有人能听懂你，每个人都在嘲笑你。

23.分院测试：哪条路最让你心动？

格兰芬多：穿过树林的曲折、树叶遍布的小路

拉文克劳：古建筑林立的鹅卵石街道

赫奇帕奇：宽阔、阳光明媚、长满青草的小路

斯莱特林：狭窄、黑暗、灯火通明的小巷

拉文克劳：躲进暗处静待事态进步，一边在心里盘算着最合适的防御和进攻咒语，是不是会出现麻烦？

赫奇帕奇：谨慎行事，将一只手放在隐藏的魔杖上并注意任何干扰？

斯莱特林：拔出你的魔杖并站稳脚跟？

25.分院测试：如果你去霍格沃茨，你会选择带哪只宠物？

格兰芬多：龙蟾

拉文克劳：谷仓猫头鹰

赫奇帕奇：普通蟾蜍

斯莱特林：黑猫

26.分院测试：黑或白？

格兰芬多、斯莱特林：黑色

拉文克劳、赫奇帕奇：白色

27.分院测试：正面或反面？

格兰芬多、斯莱特林：尾巴/反面

拉文克劳、赫奇帕奇：头/正面

28.分院测试：左还是右？

格兰芬多、赫奇帕奇：右

拉文克劳、斯莱特林：左

关于本次闪烁之光高抽测试和闪烁之光高抽活动主题奖励是啥子的难题同享到这里就结束了，如果化解了无论兄弟们的难题，大家特别高兴。